國際生醫新聞

在獲得美國 FDA 緊急使用授權 (EUA) 的眾多新冠肺炎檢測產品中，多數是以反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR) 為基礎，其次還有血清學測試、應用等溫擴增 (isothermal amplification) 技術的平台。近日，FDA 批准了一種原理不同於先前的檢測產品 ─ Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit，僅須一小時即可取得結果，且試驗過程中，準確率 100%！

Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit 是由全球 CRISPR 領航者之一的張鋒所創建的 Sherlock BioSciences 公司所開發，應用其 SHERLOCK™ 平台所製成。在此，為各為精簡介紹一下其所使用到的技術與操作流程：

1. CRISPR/Cas：

目的：偵測、識別病毒 RNA、產生可判讀訊號。

原理：近年在科學界聲名大噪的 CRISPR/Cas 系統，最初是於細菌中發現。細菌受到噬菌體感染時，會將病毒核酸切割成小片段、鑲嵌至 CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 之間的間隔序列 (spacer) 中，當下一次相同的病毒入侵時，便可迅速反應、將病毒核酸瓦解，因此，可將之視為是細菌的「免疫機制」之一。系統的另一部分「Cas」指的是由 CRISPR 相關基因 (CRISPR associated gene) 所表現出來的酵素，具有解開核酸結構、切割核酸等功能，又因為它會受到引導 RNA (guide RNA, gRNA) 的帶領，因此可以十分專一地結合、作用在特定核酸序列上。科學家便依此特性，設計出一套可以精準修改核酸的技術。

目前已知的 CRISPR/Cas 系統可分為兩大類、六型、33種亞型，最為人所知的是 CRISPR/Cas9，可辨識與切割 DNA；而上述 Sherlock CRISPR SARS-CoV-2 Kit 中所使用的，是 CRISPR/Cas13，目標物為 RNA。而 Cas13 比較特別的是，當 Cas13 在 gRNA 領導下與目標 RNA 結合後，會切割週邊包括目標 RNA 的所有 RNA 分子，因此，只要給予 CRISPR/Cas13「可辨識 SARS-CoV-2 的 gRNA」，並於溶液中混入一種「被切割後會釋出螢光」的報導 RNA (reporter RNA)，理論上，當 CRISPR/Cas13 辨識到 SARS-CoV-2 的基因，便可切割報導 RNA、產生可判讀的訊號。

2. 等溫擴增：

目的：提升靈敏度。

原理：上述的偵測系統靈敏度雖可達到 femtomolar 等級 (1 fM=10^-15 M)，但仍不符檢測的 attomolar 等級 (1 aM=10^-18 M) 需求，因此，試劑組中又納入了等溫擴增技術，利用重組酶、聚合酶以及專一性引子 (primer)，將樣本中的目標片段擴增放大，以達到femtomolar 等級以上。另外，由於等溫擴增可以在 37~42℃ 間、維持同一溫度就可反應，因此可省卻反覆升降溫的過程，方便且快速。此時，擴增出的產物為 DNA。

3. 試管內轉錄：

目的：將等溫擴增得到的 DNA 產物，轉錄為 CRISPR/Cas13 可以結合、切割的 RNA。
原理：在溶液中加入 T7 RNA聚合酶轉錄，其可以 DNA 為模板，轉錄出 RNA。

透過 2、3 中的技術，使得 SHERLOCK™ 平台可以偵測到原始僅有 attomolar 等級的病毒核酸。

操作流程：

1. 由樣本中萃取出 RNA。
2. 等溫擴增：加入酵素，在 42℃ 水浴槽中反應 25 分鐘。
3. Cas13 偵測：將 T7 RNA 聚合酶、針對病毒 S 基因或 ORF1ab 基因所設計的 gRNA、Cas13a 蛋白質和報導 RNA 加入等溫擴增後的產物中。均勻混合後，置於 37℃ 水浴槽，反應 30 分鐘。
3. 試紙讀取：以緩衝溶液稀釋最終產物，放入專用試紙、讀取結果。一如驗孕試紙判讀一般，底部的控制組底線必須呈色，才算反應正常；上方第二條線，有訊號則為陽性，無訊號為陰性。

SHERLOCK™ 平台其實並不僅止於 SARS-CoV-2 的檢測，它甚至在其他試驗中，可偵測到僅 2 aM、包裹於慢病毒 (lentivirus) 中的茲卡病毒 (zika virus, ZIKV) 和登革熱病毒 (dengue virus, DENV) RNA，並且，可以區分之 (此二者所引發的疾病在症狀上十分相似、不易分辨)！雖然仍有許多試驗必須進行，但如此的高專一性、高靈敏度、操作快速簡便的檢測方式，值得我們拭目以待！

資料來源：FierceBiotech、科學月刊、紐約州網站